液相色譜(pu)技術(shu)在(zai)食品(pin)分析中的作用(yong)

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1．前(qian)言

當代分析儀(yi)器發(fa)展的方向是高速，高靈敏度，高度，自動化(hua)和省力。在色譜法領域中，二(er)十世(shi)紀60年(nian)代后半期(qi)，氣(qi)相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)理論的應(ying)(ying)用(yong)使(shi)(shi)柱色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)得(de)到(dao)了顯著發展，而柱色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)中開(kai)發的技術和方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)又被薄(bo)(bo)層色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)和液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)所(suo)采(cai)(cai)有，從而使(shi)(shi)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)的功能大大提高，應(ying)(ying)用(yong)領域日(ri)益擴大。為(wei)(wei)了把這些現代色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)和過去的方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)相(xiang)(xiang)區(qu)別，把它們稱為(wei)(wei)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)。色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)的建立，使(shi)(shi)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)在分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析化學中的地位得(de)到(dao)了提高。如今(jin)，色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)在分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析組(zu)成復雜的物(wu)質和多(duo)組(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)混合(he)物(wu)時(shi)，是(shi)極為(wei)(wei)重要的分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)。應(ying)(ying)用(yong)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)的目的是(shi)進行定量分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析和單個分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)離出純物(wu)質。實際(ji)上(shang)，可根(gen)據分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析目的，采(cai)(cai)用(yong)氣(qi)相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)、液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)和薄(bo)(bo)層譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)中的一種或相(xiang)(xiang)互聯用(yong)之。液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)和薄(bo)(bo)層色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)中，所(suo)有可溶(rong)于流動相(xiang)(xiang)的物(wu)質均可作為(wei)(wei)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析對(dui)象。由于液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)在、簡便(bian)、快速方(fang)(fang)面倍受分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析工作者推(tui)崇。使(shi)(shi)用(yong)較為(wei)(wei)廣泛，而薄(bo)(bo)層色(se)(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)則因分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析時(shi)間(jian)較長，定量度覺差而作為(wei)(wei)液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)(se)普(pu)預實驗(yan)方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)^[1]。

液相色譜法（HPLC）是20世紀60年(nian)代發展起來的一(yi)種新(xin)型分析、分離(li)技(ji)術(shu)。它是在經典液(ye)相(xiang)色譜法(fa)(fa)的基礎上，引入氣相(xiang)色譜法(fa)(fa)的理論和(he)技(ji)術(shu)，以高壓輸送流動相(xiang)，采用固定(ding)相(xiang)及高靈敏度(du)檢測器發展而(er)成的現代液(ye)相(xiang)色譜分析方法(fa)(fa)。現代HPLC采用了小口(kou)徑(jing)柱（約1～3mm）和(he)極細(xi)小的(de)色譜填料（粒(li)徑 <5μm），用高壓(ya)輸液泵使溶(rong)劑以高流速（1～10cm/s）通(tong)過色譜柱，分(fen)離速度比經典(dian)柱色譜法(fa)快100～1000倍，分離效(xiao)率(lv)已接近毛細(xi)管柱(zhu)氣相色譜法。因此， HPLC具有高壓、高速、、高靈敏度四(si)大特點。HPLC與GC比(bi)較，雖然需要解決延長(chang)使用(yong)壽命(ming)的問題，但專家們(men)普遍認為在眾多分(fen)析領域中HPLC比GC 更(geng)加實用。HPLC能夠分(fen)析(xi)受到熱穩定性和揮(hui)發(fa)性限制的化合(he)物，而用GC分析這些(xie)化合物時則必須借助其(qi)衍生(sheng)物。由于HPLC具(ju)有高(gao)(gao)分(fen)(fen)(fen)辨(bian)率、高(gao)(gao)靈(ling)敏度(du)、速度(du)快、色譜柱可反復利(li)用(yong)、流出(chu)組分(fen)(fen)(fen)易(yi)收集等(deng)優(you)點，所以被廣泛應用(yong)到生物化學、食品(pin)分(fen)(fen)(fen)析(xi)、醫藥研究、環境(jing)分(fen)(fen)(fen)析(xi)、無機分(fen)(fen)(fen)析(xi)等(deng)領域(yu)^[2]。

2．HPLC在糖類分析中的(de)應(ying)用

糖是(shi)由(you)碳、氫、氧3種元素組成(cheng)的(de)有機化(hua)(hua)合物，亦(yi)稱碳(tan)水(shui)化(hua)(hua)合物，根據其分(fen)子結構分(fen)為單糖(tang)、雙糖(tang)、低(di)聚糖(tang)和多糖(tang)。食(shi)品分(fen)析(xi)工作(zuo)者(zhe)對糖(tang)分(fen)析(xi)方法的(de)要(yao)求是既要(yao)適用于簡單食(shi)品，又要(yao)適用于復雜加工的(de)食(shi)品，而(er)且測定要(yao)準確、迅速(su)、可靠。HPLC法測定糖具有明顯的優勢，并得到了廣泛的應用。糖的HPLC測(ce)定法(fa)主(zhu)要有兩(liang)類。一類采用(yong)陽離子交換(huan)劑或者(zhe)凝膠柱，以水(shui)、醋(cu)酸(suan)鈣溶液或稀酸(suan)等(deng)作(zuo)為流(liu)動相(xiang)(xiang)。第二類是使用(yong)化學鍵合(he)固定相(xiang)(xiang)，流(liu)動相(xiang)(xiang)為乙腈－水(shui)。

2.1 低分(fen)子糖(tang)的分(fen)析

低分子糖(tang)(tang)的分析，是指單糖(tang)(tang)到四(si)糖(tang)(tang)的分析，食品(pin)分析專(zhuan)家(jia)要求(qiu)能(neng)準(zhun)確(que)地(di)測定(ding)部(bu)(bu)分或全(quan)部(bu)(bu)果糖(tang)(tang)、葡萄糖(tang)(tang)、蔗(zhe)糖(tang)(tang)、麥芽糖(tang)(tang)和乳糖(tang)(tang)。果糖(tang)(tang)、葡萄糖(tang)(tang)、蔗(zhe)糖(tang)(tang)的分析可以提供(gong)蔗(zhe)糖(tang)(tang)轉(zhuan)化(hua)的程(cheng)度及(ji)轉(zhuan)化(hua)糖(tang)(tang)在(zai)產品(pin)中的含量;乳(ru)糖常作為脫脂奶粉等乳(ru)制品(pin)的一個主(zhu)要指標(biao);蔗糖則是zui常見的食品成分，這些都是HPLC分(fen)析食品(pin)中低分(fen)子(zi)糖(tang)的(de)(de)典型例子(zi)。用氨基(ji)鍵(jian)合相硅膠(jiao)柱進行低分(fen)子(zi)糖(tang)的(de)(de)分(fen)析時，其典型的(de)(de)色譜條件是:柱長15～25cm，流動相為(wei)乙腈溶液（乙腈20～80%），檢(jian)(jian)測用示差(cha)折光(guang)檢(jian)(jian)測器（RID），進樣量通常(chang)為10～100μL，分析時間一(yi)般在20min以內^[3]。

2.2 低聚糖的分(fen)析

低聚糖的(de)(de)分析(xi)與上述低分子糖的(de)(de)分析(xi)極為相似，同(tong)樣可用氨(an)基健合柱，但(dan)是(shi)流動相中(zhong)水的(de)(de)比例要增(zeng)加到40～60%，分(fen)析時(shi)間較長，大(da)約需(xu)要30min。近來國內(nei)已(yi)有不少文(wen)獻報導。陳洪用HPLC法(fa)測定了飴糖(tang)(tang)中的低(di)聚糖(tang)(tang)，發現飴糖(tang)(tang)中的低(di)聚糖(tang)(tang)以(yi)麥芽糖(tang)(tang)為主，含量為25～39%，另外還含少量的葡萄糖(tang)(tang)、麥芽(ya)(ya)三糖(tang)(tang)和麥芽(ya)(ya)四糖(tang)(tang)，葡萄糖(tang)(tang)、麥芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)和麥芽(ya)(ya)三糖(tang)(tang)的zui低(di)檢出限(xian)在(zai)微(wei)克級。還有文獻報導了用液相色譜法(fa)分析蔗果低(di)聚(ju)糖(tang)(tang)合成液和測定異(yi)麥芽(ya)(ya)低(di)聚(ju)糖(tang)(tang)的組(zu)分^[3]。

2.3 多糖分析

多糖(tang)的(de)分(fen)析，主要是用(yong)于分(fen)離純(chun)化及純(chun)度和分(fen)子(zi)量的(de)測(ce)定。過去常用(yong)的(de)測(ce)定方法(fa)有(you)超(chao)速離心(xin)法(fa)、高壓(ya)(ya)電泳法(fa)、滲透壓(ya)(ya)法(fa)、粘(zhan)度法(fa)和光散射法(fa)等。使用(yong)這些(xie)方法(fa)，操作麻煩，結果誤(wu)差很大。七十年(nian)代以后，由于耐高壓(ya)(ya)合(he)成(cheng)凝膠的(de)出現(xian)，HPLC已(yi)可(ke)用(yong)于多糖純度和分(fen)子(zi)量的測(ce)定以(yi)及制(zhi)備多糖的分(fen)離，這樣效果更好。

3．HPLC在(zai)氨基酸(suan)分析(xi)中(zhong)的應(ying)用

測定氨基酸的標準(zhun)方法(fa)是利(li)用與茚三酮的顯色反(fan)應(ying)和離子(zi)交換色譜法(fa)分離。但(dan)是，Baky－er，E．于1976年(nian)用HPLC法分析氨基酸(suan)是利用(yong)衍生反應(ying)，使(shi)之轉(zhuan)化成(cheng)具有(you)強(qiang)熒光(guang)衍生物檢測(ce)的(de)濃度要比茚三酮(tong)反應(ying)低4－5個數量級(ji)。所以該法要比氣相色譜法要靈(ling)敏。HPLC法的操作條(tiao)件是(shi)采用(yong)雙柱系統，柱1用梯度洗脫，柱2用恒定洗脫(tuo)。熒光檢(jian)測DNS－氨基酸的激發(fa)波長為340nm，發射(she)波(bo)長為510nm。可用正相色(se)譜分(fen)離(li)，在(zai)1毫(hao)升/分鐘(zhong)流(liu)速下，柱(zhu)溫65℃時可得到18種氨基酸的分離圖譜。也可用(yong)反相色(se)譜分離，在(zai)1.5毫升(sheng)/分鐘流速下，柱溫45℃可(ke)得到17種氨基(ji)酸的分(fen)離圖譜。檢測靈敏度和(he)操作時間比(bi)標準方法(fa)都(dou)有很大提(ti)高。

在該方(fang)法(fa)研究(jiu)的基礎上(shang)，有人先后把它(ta)用于分析糧食中的賴氨(an)酸(suan)、蛋氨(an)酸(suan)和色氨(an)酸(suan)。J．J．Warthesen和P．L．Lramer1987年(nian)報道(dao)用HPLC法測定強化小麥粉(fen)中游離的賴(lai)氨酸(suan)。他們(men)先從強化的面粉(fen)或面包中提取(qu)游離賴(lai)氨酸(suan)，用三氯(lv)醋酸(suan)沉(chen)淀蛋白質，離心后取(qu)上清液用0.1M硼酸緩沖液調PH至9.0，zui后定(ding)容(rong)到一(yi)定(ding)量(liang)。接著進行丹酰反應，讓賴氨(an)酸提取液與氯化丹酰丙酮液于40℃避光條件下反(fan)應生(sheng)成二丹(dan)酰賴(lai)氨(an)酸衍生(sheng)物(wu)。二丹(dan)酰賴(lai)氨(an)酸衍生(sheng)物(wu)通過十八烷(wan)基鍵合相柱(zhu)，以乙(yi)腈/0.01MNa₂HPO₄（2：5）為流動相(xiang)，在1.5毫(hao)升/分鐘流速下(xia)于8分鐘后分離出來，用(yong)紫外檢測器(qi)254nm外測。W．R．Peterson等(deng)人(ren)以大豆、酪蛋(dan)白(bai)、面筋(jin)、玉米(mi)為例，提出用(yong)HPLC法(fa)測定(ding)(ding)食品蛋(dan)白質中(zhong)總賴氨(an)酸(suan)和有效賴氨(an)酸(suan)的(de)分析方法(fa)。關于(yu)賴氨(an)酸(suan)的(de)測定(ding)(ding)方法(fa)與前(qian)者基本相(xiang)同，只是增(zeng)加一(yi)個用6.0NHCL水解的步驟，并把1.0毫克(ke)分子(zi)氯化丹(dan)酰(xian)丙(bing)酮液濃(nong)度提高到150毫(hao)克(ke)分子。在有效賴氨酸（具有游離ε－氨基(ji)的賴氨酸，若(ruo)ε－氨基(ji)發(fa)生變化(hua)，會(hui)使賴氨酸失(shi)去營養強(qiang)性）的測(ce)定中，又用(yong)HPLC法(fa)與氟代*分(fen)光光度法(fa)進行了比較，其分(fen)析結果沒明顯差異。而(er)且HPLC還比后(hou)者少了一個(ge)樣品(pin)凈(jing)化過程。色譜分離ε－*賴氨基(ji)仍用(yong)十八烷基(ji)鍵(jian)同相柱，乙腈/0.01M醋酸緩沖(chong)液（20：80）（PH4.0）為(wei)流(liu)動相，于紫外(wai)可見光檢(jian)測(ce)器436nm處(chu)測定^[4]。

分析強化食品中游離蛋氨酸的(de)HPLC法是Okeefe．L．L．和Warthesen．J．J．提出(chu)的，用1.0%甲醇從強(qiang)化食(shi)品中提取DL-蛋(dan)(dan)氨酸，再用(yong)三(san)氯醋酸沉(chen)淀蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)，經過濾用(yong)5NNAOH把濾液PH調至9.5，用水定(ding)容(rong)后取部分(fen)提取液(ye)進行丹酰反應。蛋(dan)氨(an)酸的丹酰衍(yan)生物與其氯化物通過十八(ba)烷基(ji)鍵合相柱，乙腈(jing)/0.01MNa₂HPO₄（1：4 ，PH7.9）作流(liu)動相，在2毫升/分(fen)鐘流速下得到分(fen)離，于紫(zi)外(wai)檢測器254mn處測定。

用HPLC法測定食(shi)品中(zhong)的(de)色氨酸(suan)是利(li)用分子(zi)本身的(de)熒光，直接通(tong)過熒光計(ji)檢測，激發波長為283nm，發射波(bo)為343nm。用多孔(kong)硅(gui)膠柱(zhu)分離，PH3.8的醋(cu)酸緩沖(chong)液(ye)作流動相，在2.5毫升/分鐘流速下獲(huo)得(de)大麥水解物的色氨酸分離(li)圖譜。檢測范(fan)圍(wei)是8×10^-9―270×10^-9克。在這(zhe)項研(yan)究(jiu)中，用含有麥芽糊精的6MNAOH水解(jie)蛋白質(zhi)(zhi)。麥(mai)芽(ya)糊(hu)精作抗氧劑，可(ke)提高某些酶(mei)（溶菌酶(mei)，胰(yi)凝乳(ru)朊酶(mei)）中(zhong)色氨酸的(de)回收(shou)(shou)，但對(dui)菜籽粉中(zhong)色氨酸的(de)回收(shou)(shou)沒影(ying)響。同時還證明蛋白質(zhi)(zhi)水解(jie)時間對(dui)色氨酸回收(shou)(shou)的(de)影(ying)響。

４．HPLC在脂肪酸分析中的應用

谷物與(yu)飼(si)料中的(de)脂肪酸提取物可以它們(men)的(de)P-溴代苯酰甲酯衍(yan)生(sheng)物形(xing)式用HPLC法分離測(ce)定。在溶(rong)于A/甲醇（2：1）液的類脂提取物(wu)中加入0.05N的氫氧化鉀/甲醇溶液(ye)，使堿與(yu)酸(suan)的克分(fen)子比例(li)至少在9：1，再(zai)通過旋轉蒸發器濃(nong)縮樣品。皂化產物不必(bi)離(li)析出來(lai)，類脂提取(qu)物在催化劑(ji)和苯酰甲基溴化物作(zuo)用下，70－80℃、30分鐘(zhong)之內可完成衍生反(fan)應。脂肪(fang)酸的(de)P－溴代苯酰甲酯衍生(sheng)物在十八烷基鍵合(he)相(xiang)柱(zhu)上分離，甲醇/水（90：10）為流(liu)動相，以(yi)1毫(hao)升/分(fen)(fen)(fen)鐘流(liu)速，室(shi)溫條件下用(yong)紫外檢測(ce)器分(fen)(fen)(fen)析(xi)。該法說明利用(yong)衍生反應分(fen)(fen)(fen)析(xi)谷(gu)物和飼料中的游(you)離脂肪酸(suan)或從甘(gan)油三酸(suan)脂衍生而來的脂肪酸(suan)都是有(you)效(xiao)的。但在(zai)等(deng)壓溶劑系(xi)統中不能把(ba)十六烷(wan)酸(suan)與油酸(suan)的衍生物分(fen)(fen)(fen)離開來，這(zhe)也(ye)是與氣相(xiang)色譜(pu)法相(xiang)比較的不同(tong)之處。不過后(hou)來有(you)人提出用(yong)梯度洗(xi)脫可(ke)以把(ba)上兩種(zhong)脂肪酸(suan)分(fen)(fen)(fen)離開^[4]。

HPLC法還可以(yi)用(yong)示差折(zhe)光檢測器分離(li)硬質小(xiao)麥(mai)及軟(ruan)質小(xiao)麥(mai)中含量不同的固醇軟(ruan)脂酸鹽(yan)(yan)和固醇亞(ya)油(you)酸鹽(yan)(yan)，在多孔硅膠柱上分離(li)，己(ji)烷/氯紡（9：1）作流動(dong)相。

５．HPLC在維(wei)生素分析(xi)中(zhong)的(de)應用

維生(sheng)素C是一種對人體十(shi)分重要但人體自身又不能(neng)合成的一類重要化合物。由于它具(ju)有抗(kang)壞(huai)血(xue)酸(suan)的生理(li)功能(neng)，又名抗(kang)壞(huai)血(xue)酸(suan)，若嚴重缺乏會引起壞(huai)血(xue)病(bing)。維生素C還(huan)可參與體(ti)內氧化還(huan)原反應，具有解(jie)毒的作用。30 年代時，維生素C就被(bei)廣泛用于增加機體對傳染病(bing)的(de)(de)抵抗(kang)力，近年的(de)(de)研(yan)究(jiu)表明(ming)維生素C可預防癌癥，并對肝(gan)炎、肝(gan)硬變有療效。它(ta)可促進膠原蛋白抗體的形成，因(yin)膠原蛋白能包圍癌細胞(bao)，維生素C具(ju)(ju)有抗癌作用(yong)，因它(ta)能參與(yu)神經(jing)介(jie)質、激(ji)素的生物合成，同時(shi)具(ju)(ju)有預防感冒、增強機體免疫力(li)等功(gong)能^[5]。人體(ti)自身不能合成維生(sheng)素C，必(bi)須從食(shi)物攝取。維生(sheng)素C廣泛存在于新鮮水果和蔬菜中，測定方法(fa)一般有比色法(fa)、熒光(guang)分光(guang)光(guang)度(du)法(fa)、化學滴定法(fa)等。由于上述方法(fa)操(cao)作煩瑣，近年來多采用(yong)液相色譜法(fa)測定^[6]。

對于維生(sheng)素的分(fen)析，除了個別幾種維生(sheng)素（維生(sheng)素B6、B12和維生素(su)H等）必須采用微生物法(fa)(fa)進(jin)(jin)行(xing)測定外，大(da)多數維(wei)生素均可采用液相色譜法(fa)(fa)進(jin)(jin)行(xing)分析(xi)。水溶性(xing)維(wei)生素（B1、B2、C）的測定，將樣品用酸消化(hua)后，用酶分解蛋白質(zhi)，然后用溶劑(ji)提(ti)取出維生素，而脂(zhi)溶性維生素（A、K、E）的測定則將(jiang)食(shi)品進行皂化(hua)處(chu)理后，提取不皂化(hua)物(wu)，然后再從不皂化(hua)物(wu)中(zhong)將(jiang)維(wei)生素(su)萃(cui)取出(chu)來，預處(chu)理后的兩類維(wei)生素(su)，通過液(ye)相色譜－紫(zi)外(wai)/可見(jian)檢測(ce)(ce)(ce)(ce)器(qi)(qi)在各(ge)自所固有的(de)波長條(tiao)件(jian)下進行(xing)定(ding)量測(ce)(ce)(ce)(ce)定(ding)。液相(xiang)色譜法根據不(bu)同的(de)要求(qiu)，所選(xuan)擇的(de)固定(ding)相(xiang)、流(liu)動相(xiang)、流(liu)速、檢測(ce)(ce)(ce)(ce)器(qi)(qi)和檢測(ce)(ce)(ce)(ce)波長都不(bu)相(xiang)同。多數方法采用熒光檢測(ce)(ce)(ce)(ce)器(qi)(qi)、電化學檢測(ce)(ce)(ce)(ce)器(qi)(qi)、紫外檢測(ce)(ce)(ce)(ce)器(qi)(qi)或在檢測(ce)(ce)(ce)(ce)中變換(huan)檢測(ce)(ce)(ce)(ce)波長。李(li)學梅測(ce)(ce)(ce)(ce)定(ding)保(bao)健食品中維生(sheng)素(su)C時，選(xuan)用的色(se)譜條件為(wei)EclipseXDB－C18 416mm×250mm 5μm柱、C18416mm×20mm 5μm預柱，流動相為(wei)甲(jia)醇(chun)：0102mol/L^[2]。

6．HPLC在其他(ta)物質(zhi)分析中的應用

6.1 HPLC在酸奶(nai)研(yan)究中(zhong)的應(ying)用

隨著(zhu)現代(dai)分(fen)析(xi)手(shou)段的不(bu)斷(duan)更新(xin)，越來越多高靈(ling)敏度、高準確度的先(xian)進分(fen)析(xi)技術和方法被用于(yu)酸奶(nai)的分(fen)析(xi)檢驗。由于(yu)液相色譜（HPLC）具有快速、方便、分(fen)辨率高、分(fen)離效果好、重現(xian)性好等(deng)優點，可(ke)將其用于檢測酸(suan)奶(nai)中富含(han)的(de)糖、脂、氨(an)基(ji)酸(suan)、維生素(su)等(deng)營(ying)養物質(zhi)。原理(li)(li)是樣(yang)品先經預(yu)處理(li)(li)后，進行液相色譜分(fen)析(xi)，HP柱用(yong)粒(li)徑為(wei)5～10μm的(de)(de)全多孔微粒擔體作(zuo)載體，將洗脫(tuo)劑（流(liu)動相(xiang)(xiang)）以高(gao)壓泵(beng)注(zhu)入柱(zhu)內，形成(cheng)顯著的(de)(de)壓力降，樣品組分(fen)(fen)迅速連續不斷的(de)(de)在兩(liang)相(xiang)(xiang)間(jian)進(jin)行反(fan)復多次平衡分(fen)(fen)配，以達到(dao)分(fen)(fen)離的(de)(de)目的(de)(de)，各組分(fen)(fen)流(liu)出(chu)順序依其(qi)組分(fen)(fen)對兩(liang)相(xiang)(xiang)間(jian)的(de)(de)相(xiang)(xiang)對親和性(xing)。分(fen)(fen)離后(hou)的(de)(de)組分(fen)(fen)通過鑒定器產生(sheng)訊號，經放大后(hou)在記錄儀上(shang)繪(hui)出(chu)色譜峰(feng)^[7]。

6.2 HPLC法測(ce)定紅葡萄酒(jiu)中的白藜蘆醇

液相色譜(pu)法(fa)測定(ding)紅葡(pu)萄酒中(zhong)白藜(li)蘆醇(chun)及其(qi)甙的順、反異構(gou)體，操作(zuo)簡單，精密(mi)度高(gao)，重復性好，可(ke)用于葡(pu)萄酒中(zhong)白藜(li)蘆醇(chun)4種異構體的測定(ding)。*，適量飲用(yong)紅葡(pu)萄酒(jiu)對健康極為有益白藜蘆醇（resveratrol，簡(jian)稱(cheng)RV）是紅(hong)葡萄酒中發(fa)揮保護作用的主(zhu)要功能因子。白藜蘆醇的化學名(ming)為3，4’，5-三(san)羥基二(er)乙烯(xi)，在自然狀(zhuang)態(tai)下，其3位(wei)羥基(ji)上的氫原子被一個葡萄(tao)糖分子取(qu)代形成了白藜(li)蘆醇甙（piceid，簡稱PD）。已有報道證實白(bai)(bai)藜(li)(li)蘆醇(chun)具有抗(kang)(kang)炎、抗(kang)(kang)菌、抗(kang)(kang)氧化、調節(jie)脂代謝、抗(kang)(kang)凝血(xue)、調節(jie)雌激素作用及抗(kang)(kang)腫(zhong)瘤等多種生物活(huo)性(xing)，因(yin)此葡萄酒(jiu)（汁）中白(bai)(bai)藜(li)(li)蘆醇(chun)含量(liang)的高低自然成為影(ying)響其保健(jian)功效的因(yin)素之一(yi)。

　　采用液(ye)相色譜法（HPLC）測定白藜(li)蘆醇含量已有(you)一些報道[。用液(ye)相色譜(pu)法測(ce)定水解前(qian)后順、反(fan)式白藜蘆醇含(han)量的(de)變化,從而計算(suan)出葡萄酒中(zhong)白藜蘆醇的4種異構體(ti)的含量(liang)。色譜柱為(wei)SymmetryC18柱（319 mm i.d.×150 mm），流動相為乙醇-0.05%乙酸(suan)水溶(rong)液（體(ti)積比為23∶77），紫外檢測波長為306nm。其(qi)特(te)點在于：采用陽光(guang)照射(she)將(jiang)白藜蘆醇及其(qi)甙的反式異構體部分轉化(hua)成順(shun)式異構體;利用β-2葡萄(tao)糖苷酶將(jiang)順(shun)式(shi)及反式(shi)白藜蘆醇甙中的(de)β-2葡萄糖苷鍵水解(jie)成為相應的(de)白藜蘆醇異構(gou)體，從而解(jie)決了因葡萄酒中白藜蘆醇甙峰與其他組分峰重(zhong)疊而不能(neng)被(bei)直(zhi)接測(ce)定的(de)問(wen)題;通(tong)過測定酶水解前(qian)后葡萄酒（汁）中順式(shi)、反式(shi)白藜(li)蘆(lu)醇含量的變化，計算出葡萄酒（汁）中白藜(li)蘆(lu)醇及其甙的順、反異構(gou)體的含量^[8]。

6.3 HPLC法分析(xi)羅漢(han)果(guo)中主要皂甙成分的(de)研究

羅(luo)漢(han)果(guo)葫蘆科羅(luo)漢(han)果(guo)屬多年生草(cao)質藤本植(zhi)(zhi)物的成熟果(guo)實，是(shi)我國傳統的藥用(yong)植(zhi)(zhi)物，臨床上可用(yong)于(yu)治療高血壓、肺結(jie)核、哮(xiao)喘、胃(wei)炎、百日咳、急(ji)慢(man)性氣管炎和急(ji)慢(man)性扁(bian)桃腺炎等(deng)疾(ji)病(bing)。羅(luo)漢(han)果(guo)的主要(yao)活(huo)性成分(fen)是(shi)葫蘆素烷三萜類皂(zao)甙(dai)，關(guan)于(yu)羅(luo)漢(han)果(guo)皂(zao)甙(dai)的分(fen)析，目前(qian)普遍應用(yong)的是(shi)香(xiang)(xiang)草(cao)醛－硫酸(suan)比色(se)(se)法和香(xiang)(xiang)草(cao)醛－高氯酸(suan)比色(se)(se)法測定總皂(zao)甙(dai)含量^[9]，但分光光度法的穩定性及專屬性差(cha)。H．C．Makapugay等(deng)建(jian)立的液相分析方法，僅能(neng)分析羅漢果甙V，不能分離分析(xi)其他皂甙組。張(zhang)云竹等^[10]建立一種快速的(de)(de)高壓液相分(fen)析方法，對羅漢果(guo)中的(de)(de)主要(yao)皂甙成分(fen)進(jin)行測定。以C18柱為色譜柱，采用反相液相法(fa)分離(li)分析羅漢果皂(zao)甙。結果建立了羅漢果皂(zao)甙的(de)HPLC分析條件，其(qi)色譜條件為：流動相23%的(de)乙腈水(shui)溶液；流速(su)1ml/min；檢測波長210nm；柱溫(wen)為室溫(wen)；靈(ling)敏度0.04AUFS。采用上述的(de)(de)液相分析(xi)方(fang)法分析(xi)四種羅漢(han)果皂甙的(de)(de)含(han)量，發現該方(fang)法簡便、快速、準(zhun)確(que)、線性(xing)范圍在0.5～13.75μg之間，且線(xian)性關系良(liang)好（R≥0.99），加標回收率高(gao)（94.46%～105.05%），精密度良(liang)好(hao)（RSD=1.40%～3.31%）。因此HPLC方法可用于分析羅漢果及(ji)其制品中(zhong)的羅漢果皂甙含量。

6.4 HPLC法對N－亞硝胺的測定

N-亞硝胺可誘發肝癌、結腸癌等。某些 N-亞硝胺化合物，如 N-亞(ya)硝基二甲胺、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基四氫吡咯等也是一(yi)(yi)類致癌物質。過去(qu)采用氣相色譜(pu)法測(ce)(ce)定食物中(zhong)揮(hui)發性亞硝胺，其中(zhong)僅色譜(pu)測(ce)(ce)定一(yi)(yi)步便(bian)需耗時(shi)1h之(zhi)多，而采用液(ye)相(xiang)色譜法則只需要13min。

6.5 HPLC法(fa)對芳香胺的測定

芳香胺(an)在合成色(se)素中(zhong)應(ying)較多。當食(shi)品中(zhong)色(se)素添加過(guo)量(liang)時，對人(ren)體可造成害。因此芳香胺(an)的(de)分(fen)離測定在食(shi)品安(an)全(quan)上也(ye)很重要。各種二胺(an)異構(gou)體的(de)分(fen)離測定可采用PermaphaseETH譜柱，移動相(xiang)同甲醇－環(huan)戊烷(wan)（5∶95）。2，6-甲苯胺(an)、2，3-二甲苯胺(an)及苯胺(an)的(de)分離可(ke)用Durpakcarbowax400/Corasil，淋洗液(ye)為異(yi)丙醇－已烷（10∶90）。硝基苯(ben)胺異(yi)構(gou)體(ti)的分離用Vydac吸(xi)附劑，用已烷－A（1∶1）作淋洗液。按鄰、對間位順(shun)序沖出(chu)，分離時間為3min~18min^[11]。

6.6 HPLC法對黃曲(qu)霉毒(du)素的測定

黃(huang)曲霉毒(du)素是黃(huang)曲霉菌類所產生的代謝產物。各(ge)種發霉的食(shi)物如花(hua)生、大米(mi)、玉(yu)米(mi)等，都可能遭(zao)此種毒(du)素污染。現已(yi)確定黃(huang)曲霉毒(du)素有B1、B2、B2a、G1、G2、G2a、M1、M2等 8種結構的(de)類(lei)似物。這(zhe)些毒(du)素毒(du)性(xing)*，在實驗動物身上幾個微(wei)克(ke)便(bian)能誘(you)致肝癌(ai)的(de)發生。液相色譜法(fa)分離(li)測定黃曲(qu)霉毒(du)素，可采用Sli-X-Ⅱ，室溫下A－異辛(xin)烷淋洗，B1、B2、G1、G2依(yi)次沖出，分(fen)析時間約7min。如PermaphaseETH，2-丙(bing)醇(chun)-水（3∶97）則以G1、B2、G2、B1次序沖(chong)出。由于黃曲霉毒素(su)在254納(na)米吸(xi)收很(hen)強，因(yin)此可檢測出10－9。此外，此毒素還(huan)能產生熒光(guang)，應用(yong)熒光(guang)檢(jian)測器則檢(jian)出靈敏度(du)可更高(gao)。

7．結語

液(ye)相色(se)譜法只(zhi)要求樣(yang)品(pin)能制成溶液(ye)，不(bu)受樣(yang)品(pin)揮(hui)發性的(de)(de)(de)限制，流動相可選擇的(de)(de)(de)范圍(wei)寬(kuan)，固定(ding)相的(de)(de)(de)種(zhong)類繁多，因而(er)可以分(fen)離熱(re)不(bu)穩(wen)定(ding)和非揮(hui)發性的(de)(de)(de)離解(jie)的(de)(de)(de)和非離解(jie)的(de)(de)(de)以及各種(zhong)分(fen)子量范圍(wei)的(de)(de)(de)物質。與(yu)試樣(yang)預處(chu)理技術(shu)相配合(he)，HPLC所達到的(de)高分(fen)(fen)辨率和高靈敏度，使(shi)分(fen)(fen)離和同時測定(ding)性質上十分(fen)(fen)相近的(de)物質成為(wei)可能，能夠分(fen)(fen)離復雜(za)相體(ti)中的(de)微量成分(fen)(fen)。隨著固定(ding)相的(de)發展(zhan)，有可能在(zai)充(chong)分(fen)(fen)保(bao)持生化物質活性的(de)條件(jian)下完成其分(fen)(fen)離。由于高壓輸液(ye)泵(beng)的(de)使(shi)用，相對(dui)于經(jing)典液(ye)相色(se)譜，其分(fen)(fen)析(xi)時間(jian)大大縮短(duan)，當輸液(ye)壓力增加時，流(liu)動相流(liu)速(su)會加快，完成一個樣品(pin)的(de)分(fen)(fen)析(xi)時間(jian)僅需(xu)幾(ji)分(fen)(fen)鐘到幾(ji)十分(fen)(fen)鐘。因此，液(ye)相色(se)譜技術在(zai)食品(pin)分(fen)(fen)析(xi)領域具有巨大的(de)現實意(yi)義。